La miocardiopatía hipertrófica induce cambios en la expresión de la triptófano-5-hidroxilasa, el transportador de serotonina y receptores serotoninérgicos / Hypertrophic cardiomyopathy induces changes in the tryptophan-5-hydroxylase, serotonin transporter and serotonergic receptors expressions

Resumen Introducción: Los cardiomiocitos poseen la maquinaria bioquímica capaz de sintetizar, utilizar y recapturar serotonina. Objetivo: Determinar si la miocardiopatía hipertrófica (MCH) induce cambios en la expresión de la triptófano-5-hidroxilasa (TPH) 1 y 2, el transportador de serotonina (SERT) y los receptores serotoninérgicos (RS). Métodos: Estudio transversal de cinco bloques de tejido de corazones con MCH y cinco bloques de corazones de control. Se obtuvieron cinco cortes de la pared libre del ventrículo izquierdo (PLVI) y del septum interventricular (SIV) de cada bloque, para determinar la expresión de TPH1 y TPH2, SERT y RS con anticuerpos por inmunofluorescencia. La inmunofluorescencia fue evaluada mediante t de WELCH, con nivel de significación de p < 0.05. Resultados: La PLVI y el SIV de los corazones con MCH mostraron aumento de la expresión de TPH1 y TPH2, así como de los receptores 5-HT2A y 5-HT2B en comparación con los controles (p < 0.01). El receptor 5-HT4 y SERT aumentaron en el SIV de los corazones con MCH (p < 0.01). Conclusiones: Se demostró aumento de las expresiones de TPH, SERT y RS en los cardiomiocitos de los corazones con MCH en comparación con los controles, lo cual podría participar en la fisiopatología de la MCH en los humanos.

Abstract Introduction: Cardiomyocytes have a biochemical machinery with the capacity to synthesize, utilize and reuptake serotonin. Objective: To determine whether hypertrophic cardiomyopathy (HCM) induces changes in the expression of tryptophan-5-hydroxylase (TPH) 1 and 2, serotonin transporter (SERT) and serotonergic receptors (SR). Methods: Cross-sectional study of five tissue blocks from hearts with HCM and five controls. Five sections of the left ventricular free wall (LVFW) and interventricular septum (IVS) were obtained from each block to determine the expression of TPH1 and TPH2, SERT and SRs by immunofluorescence with specific antibodies. Immunofluorescence was evaluated by WELCH t-test, with a level of significance of p < 0.05. Results: LVFW and IVS of hearts with HCM showed an increase in the expression of TPH1 and TPH 2 and 5-HT2A and 5-HT2B receptors in comparison with controls (p < 0.01). The 5-HT4 receptor and SERT showed an increase in the IVS of hearts with HCM (p < 0.01). Conclusions: This study demonstrated an increased expression of TPH, SERT and SRs in cardiomyocytes from hearts with HCM in comparison with controls, which could be involved in the pathophysiology of HCM in humans.

Efeito Cardioprotetor da Suplementação Materna com Resveratrol sobre a Toxicidade Induzida por Doxorrubicina em Cardiomiócitos de Neonatos / Cardioprotective Effect of Maternal Supplementation with Resveratrol on Toxicity Induced by Doxorubicin in Offspring Cardiomyocytes

Resumo Fundamento A doxorrubicina (DOX) é frequentemente usada para tratar muitos tipos de cânceres, apesar da cardiotoxicidade dose-dependente. Como alternativa, o resveratrol é um polifenol que tem demonstrado efeitos cardioprotetores em vários modelos de disfunção cardíaca. Objetivo Este estudo investigou se o tratamento com resveratrol em ratas gestantes protege contra toxicidade induzida por doxorrubicina em cardiomiócitos da ninhada. Métodos Ratas Wistar (n-8) receberam sresveratrol como suplemento alimentar durante a gestação. No nascimento da ninhada, os corações (9-11) foram usados para se obter a cultura primária de cardiomiócitos. A cardiotoxicidade induzida por DOX e os efeitos da suplementação com resveratrol foram avaliados por marcadores de stress oxidativo, tais como oxidação da diclorofluoresceína diacetato, diminuição da atividade de enzimas antioxidantes, e oxidação do teor total de grupos sulfidrila, além da avaliação da viabilidade celular, geração de danos ao DNA, bem como a resposta de reparo aos danos ao DNA. Um valor de p <0,05 foi considerado estatisticamente significativo. Resultados Os cardiomiócitos de neonatos de ratas que receberam suplemento resveratrol apresentaram um aumento (p <0,01) na viabilidade das células, e diminuição (p <0,0001) de células apoptóticas/necróticas após o tratamento com DOX, o que está correlacionado às atividades de enzimas antioxidantes e produção de diclorofluoresceína. Além disso, o resveratrol protegeu os cardiomiócitos de danos ao DNA induzidos por DOX, apresentando uma diminuição (p <0,05) nas quebras de DNA induzidas por stress oxidativo, avaliadas pela atividade de enzimas reparadoras do DNA endonuclease III e formamidopirimidina glicosilase. A suplementação com resveratrol aumentou (p <0,05) a expressão da proteína reparadora Sirt6 nos cardiomiócitos dos filhotes. Conclusão Essa pesquisa indica que a suplementação com resveratrol durante o período gestacional tem um efeito cardioprotetor no coração da ninhada contra a toxicidade induzida por DOX, o que pode se dever a sua função antioxidante, e o aumento na resposta de danos ao DNA.

Abstract Background Doxorubicin (DOX) is frequently used to treat many types of cancers, despite its dose-dependent cardiotoxicity. Alternatively, resveratrol is a polyphenol that has shown useful cardioprotective effects in many heart dysfunction models. Objective This study investigated whether resveratrol treatment in pregnant rats protects against doxorubicin-induced toxicity in offspring cardiomyocytes. Methods Wistar rats (n=8) were supplemented with dietary resveratrol during pregnancy. Upon the offspring's birth, hearts (9-11) were used to obtain the primary culture of cardiomyocytes. DOX-induced cardiotoxicity and the effects of resveratrol supplementation were evaluated by oxidative stress markers, such as dichlorofluorescein diacetate oxidation, decrease in the activity of antioxidant enzymes, and oxidation of total sulfhydryl content, in addition to cell viability evaluation, DNA damage generation, and DNA damage repair response. A value of p<0.05 was considered statistically significant. Results Neonatal cardiomyocytes from resveratrol supplemented rats exhibiting an increase (p<0.01) in cell viability and lower (p<0.0001) apoptotic/necrotic cells after DOX treatment, which correlates with the activities of antioxidant enzymes and dichlorofluorescein production. Moreover, resveratrol protected cardiomyocytes from DOX-induced DNA damage, showing a decrease (p<0.05) in DNA breaks induced by oxidative stress, evaluated by the activity of DNA-repair enzymes endonuclease III and formamidopyrimidine glycosylase. Supplementation with resveratrol increased (p<0.05) the expression of the repair protein Sirt6 in the cardiomyocytes of the pups. Conclusion This research indicates that supplementation with resveratrol during the gestational period has a notable cardioprotective effect on the offspring's heart against DOX-induced toxicity, which may well be due to its antioxidant function, and the increase in the DNA damage repair response.

Kinin B2-Receptor in human iPSC differentiation into cardiomyocytes / Receptor B2 de cininas na diferenciação de iPSC humanas em cardiomiócitos

Cardiovascular diseases are responsible for almost one third of all global deaths yearly, and therefore are largely studied. Cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC-CM) have emerged as an exciting technology for cardiac disease modelling and personalised therapy. Nevertheless, issues concerning functional and molecular maturation are still faced. In addition to this, differentiation protocols generally yield a heterogeneous mixed population comprised of nodal, atrial and ventricular-like subtypes, being unsuitable for therapeutic purposes. Bradykinin (BK) is a vasoactive peptide which exerts important physiological roles in the cardiovascular system, having been previously described as important for cellular, keratinocyte and skeletal muscle differentiation. This project performed in cooperation with PluriCell Biotech, a startup specialized in the production and differentiation of hiPSC-CM, has sought (1) characterizing gene and protein expression of molecular markers of maturation and of subtype specification throughout of differentiation; (2) Assessing the electrical functionality of hiPSC-CM through the characterization of subtype-specific action potentials (APs) and (3) Investigating whether the progress of hiPSCCM maturation is regulated by BK through kinin-B2 receptors (B2R). Our results have validated the model that proposes a developmental-dependent switch between skeletal (ssTnI) and cardiac (cTnI) isoforms of troponin I as differentiation progresses, at least to some extent. Furthermore, prolonged time in culture has resulted in higher levels of expression of the ventricular marker MLC2v and in increased rates of ventricular-like action APs. Electrophysiological analysis of hiPSC-CM reveals a mixed population with AP morphologies correspondent to nodal, atrial and ventricular subtypes, all showing pronounced automaticity as well as other features of immature cardiomyocytes, such as low amplitude and depolarization velocity. Such findings are coherent with those from other groups who have attempted to differentiate mature native-like cardiac cells from pluripotent stem cells sources, without fully succeeding. After showing that differentiating hiPSC-CM express a functional and responsive B2R, the receptor was subjected to chronic activation with 10µM BK and 1µM BK or inhibition with 5µM Firazyr+BK. Even though B2R modulation has not interfered negatively with differentiation yields nor cell morphology, analysis of gene andprotein expression of ssTnI or cTnI and of the ventricular marker MLC2v, have revealed no significant results in comparison to untreated controls. This suggests that BK does not interfere on hiPSC-CM maturation nor subtype specification, although we cannot rule out that it could be leading to other unexplored effects. We recommend a closer look into which intracellular signalling pathways become active upon B2R stimulation in hiPSC-CM, in order to narrow down cellular processes for further investigation

Doenças cardiovasculares são responsáveis por quase um terço de todas as mortes globais anualmente, e por isto o sistema cardiovascular é amplamente estudado. Cardiomiócitos derivados a partir de células-tronco pluripotentes induzidas humanas (hiPSCCM) emergiram como uma promissora tecnologia para modelagem de doenças cardíacas e terapia personalizada. No entanto, desafios acerca de sua maturação funcional e molecular ainda são enfrentados. Além disso, protocolos de diferenciação geralmente levam à obtenção de populações heterogêneas contendo células com fenótipos similares aos de cardiomiócitos nodais, atriais e ventriculares sendo, portanto, inapropriadas para fins terapêuticos. A bradicinina (BK) é um peptídio vasoativo que exerce importantes papeis fisiológicos no sistema cardiovascular, além de ter sido previamente descrita como importante para a diferenciação neuronal, de queratinócitos e de músculo esquelético. Este projeto foi realizado em colaboração com a empresa PluriCell Biotech, uma startup especializada na produção e diferenciação de hiPSC-CM, e buscou (1) caracterizar a expressão gênica e proteíca de marcadores moleculares de maturação e de especificação de subtipos cardíacos durante a diferenciação; (2) avaliar a funcionalidade elétrica de hiPSC-CM por meio da caracterização de seus potenciais de ação (PAs) e (3) Investigar se o progresso da diferenciação de hiPSCCM é regulado por bradicinina por meio do receptor B2 (B2R). Nossos resultados validaram o modelo que propõe um switch na expressão das isoformas funcionais de troponina I esquelética (ssTnI) e cardíaca (cTnI), durante o desenvolvimento e diferenciação celular, pelo menos parcialmente. Além disso, tempo prolongado em cultura resultou em maiores níveis de expressão do marcador ventricular MLC2v, assim como maiores frequências de PAs com morfologias similares a de cardiomiócitos ventriculares. Análise eletrofisiológica de hiPSCCM revelam a existência de uma população mista contendo PAs correspondentes aos subtipos nodais, atriais e ventriculares, assim como pronunciada automaticidade e outros atributos típicos de cardiomiócitos imaturos, como baixa amplitude e devagar velocidade de despolarização. Estes resultados são coerentes com os de outros grupos que ainda não foram totalmente bem-sucedidos em diferenciar células cardíacas maduras similares acardiomiócitos nativos a partir de células-troncos pluripotentes. Após mostrar que as hiPSCCM expressam receptores B2 funcionais e responsivos, submetemos o receptor a uma ativação crônica com BK 10µM e BK 1µM ou inibição crônica com Firazyr 5µM + BK. Apesar da modulação do B2R não ter interferido de forma negativa no rendimento da diferenciação ou na morfologia celular, análise de expressão gênica e proteica de ssTnI e cTnI e do marcador ventricular MLC2v não revelou resultados significativos em comparação aos controles não-tratados. Isto sugere que a BK não interfere na maturação e especificação de subtipos cardíacos em hiPSC-CM, apesar de não podermos ignorar o fato de que ela poderia estar desencadeando outros efeitos inexplorados. Nós recomendamos um estudo mais aprofundado acerca de quais vias de sinalização se tornam ativas após estimulação do receptor B2 em hiPSC-CM, com o objetivo de afunilar quais processos celulares poderiam ser investigados em uma próxima etapa deste estudo

Efecto del ácido lipoteicoico sobre la expresión de genes en cardiomiocitos de ratón (H9c2) / Effect of lipoteichoic acid on gene expression in mice (H9c2) cardiomyocite

La mayoría de las enfermedades de la pulpa dental y de los tejidos perirradiculares guardan relación con microorganismos. Los peptidoglucanos y el ácido lipoteicoico son dos de los principales componentes de las bacterias Gram positivas que tienen actividades relacionadas con el desarrollo de sepsis. Tras la invasión microbiana de estos tejidos, el huésped responde con defensas tanto inflamatorias inespecíficas como inmunológicas específicas. El tratamiento endodóncico quirúrgico y no quirúrgico son en esencia, procedimientos de desbridamiento destinados a destruir y eliminar el ecosistema microbiano, asociado con el proceso patológico. Es importante que los clínicos comprendan la íntima relación entre presencia de microorganismos y enfermedad endodóncica, con el fin de diseñar un tratamiento racional y efectivo; sobre todo en aquellos individuos susceptibles a Endocarditis Infecciosa. En el presente estudio se investigó la expresión de TNFα, IL-1 y COX-2 por efecto del ácido lipoteicoico (ALT) de Streptococcus sanguinis caracterizando las señales intracelulares involucradas en cardiomiocitos H9c2. La línea celular fue tratada con ALT a diferentes concentraciones durante 30 minutos. Comparadas con los controles, las respuestas al tratamiento con ALT fueron dependientes de la dosis y mediante un análisis de One Step RT-PCR (Invitrogen) se evaluó dicha expresión; la cual se asemeja a la respuesta fisiológica del organismo durante un episodio de Endocarditis infecciosa y a la agudización durante un procedimiento endodóncico.

Most dental pulp diseases and diseases of tissues surrounding the root are somehow related to micro-organisms. Peptidoglycans and lipoteichoic acid are two of the main Gram-positive bacteria components with activities related to sepsis development. When tissues sustain microbial invasion the host responds with both unspecific inflammatory defenses and specific immunological reactions. Surgical and non surgical endodontic treatments are essentially debridement procedures intended to destroy and eliminate the microbial eco-system associated to the pathological process. It is essential for clinicians to understand the intimate relationship existing between micro-organisms and endodontic disease, so as to be able to tailor a rational and effective treatment especially in subjects susceptible to infective endocarditis processes. In the present study research was conducted on TNFα, IL-1 COX-2 expression through the effect of lipoteichoic acid (LTA) of Streptococcus sanguinis by characterizing intra-cellular signals involved in H9c'' cardiomyocytes. The cell line was treated with LTA at different concentrations during 30 minutes. When compared to control group, responses to LTA treatment were dependent on dosage. That expression was assessed by means of a One Step RT-PCR (Invitrogen) analysis. It was noted that the aforementioned expression resembled the organisms's physiological response during an infective endocarditis episode and to exacerbation observed during an endodontic procedure.

Diferenciação de células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo em cardiomiócitos / Differentiation of adipose tissue-derived mesenchymal stem cells into cardiomyocytes

FUNDAMENTO: O potencial de renovação e proliferação dos cardiomiócitos, in vivo, é pequeno, e por isso, o músculo cardíaco apresenta limitada capacidade de repor células perdidas. Na tentativa de minimizar os danos oriundos de lesões hipóxico-isquêmicas e daquelas que acometem o sistema de condução do coração, a terapia celular com células-tronco mesenquimais (MSC) vem sendo utilizada, inclusive com cardiomiócitos diferenciados a partir de MSC. OBJETIVO: O presente trabalho comparou três protocolos distintos de indução de diferenciação objetivando a sugestão de um método viável para a diferenciação de maior número de células funcionais que expressem fenótipo cardiomiogênico. MÉTODOS: Culturas de MSC obtidas de tecido adiposo de ratos jovens da linhagem Lewis transgênicos para proteína verde fluorescente (GFP) foram submetidos a três diferentes meios de diferenciação cardiogênica: Planat-Bérnard, 5-azacitidina e meio Planat-Bérnard + 5-azacitidina e observadas quanto a expressão de marcadores celulares cardíacos. RESULTADOS: Nos três protolocos utilizados observou-se formação da proteína alfa-actinina sarcomérica no citoesqueleto das células submetidas à diferenciação, expressão de conexina 43 na membrana nuclear e citoplasmática e formação de gap junctions, necessárias para a propagação do impulso elétrico no miocárdio, contudo, em nenhum protocolo foi observada contração espontânea das células submetidas à diferenciação cardiogênica. CONCLUSÃO: A indução com 5-azacitidina proporcionou diferenciação celular cadiomiogênica efetiva e similar à encontrada com o meio Planat-Bénard e, por ser um protocolo mais simples, rápido e com menor custo torna-se o método de eleição.

BACKGROUND: Cardiomyocytes have small potential for renovation and proliferation in vivo. Consequently, the heart muscle has limited capacity of self-renewal. Mesenchymal stem cells (MSC) therapy, as well as MSC differentiated into cardiomyocytes, has been used in the attempt to minimize the effects of ischemic-hypoxic lesions and those affecting the electrical conduction system of the heart. OBJECTIVE: The present study compared three distinct protocols for induced differentiation of MSC into cardiomyocytes aimed at finding a viable method for producing a large number of functional cells expressing cardiomyogenic phenotype. METHODS: Mesenchymal stem cells were obtained from the adipose tissue of young transgenic Lewis rats expressing green fluorescent protein (GFP), and submitted to three distinct differentiation-inducing media: 1) Planat-Bérnard, 2) 5-azacytidine, and 3) Planat-Bérnard + 5-azacytidine; further, these cells were identified based on the expression of cardiac cell markers. RESULTS: All three protocols detected the expression of sarcomeric-alpha-actinin protein in the exoskeleton of cells, expression of connexin-43 in the nuclear and cytoplasmic membrane, and formation of gap junctions, which are necessary for electrical impulse propagation in the myocardium. However, no spontaneous cell contraction was observed with any of the tested protocols. CONCLUSION: Induction with 5-azacytidine provided an effective cadiomyogenic cellular differentiation similar to that obtained with Planat-Bénard media. Therefore, 5-azacytidine was the method of choice for being the simplest, fastest and lowest-cost protocol for cell differentiation.

Uso de fluorescência em um método de dissector modificado para estimar o número de miócitos no tecido cardíaco / Use of fluorescence in a modified disector method to estimate the number of myocytes in cardiac tissue / Uso de fluorescencia en un método de disector modificado para estimar el número de miocitos en el tejido cardíaco

FUNDAMENTO: Métodos convencionais de dissector atualmente requerem consideráveis custos financeiros, técnicos e operacionais para estimar o número de células, incluindo cardiomiócitos, em uma área de 3D. OBJETIVO: Usar a microscopia de fluorescência em um método de dissector modificado para determinar o número de miócitos no tecido cardíaco em condições normais e patológicas. MÉTODOS: O estudo empregou camundongos Wistar machos com quatro meses de idade e peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados em grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Os animais do GI foram inoculados com cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Após oito semanas, os animais foram pesados e sacrificados. Os Ventrículos Esquerdos (VE) foram removidos para análise estereológica da densidade numérica de cardiomiócitos (Nv [c]) e o número total dessas células no VE (N [c]). Esses parâmetros foram estimados usando um dissector fluorescente (DF) e comparados com os métodos convencionais de dissector óptico (DO) e dissector físico (DFi). RESULTADOS: Em ambos os métodos de dissector, os animais do GI apresentaram queda significativa de Nv[c] e N[c] em comparação com os animais do GC (P > 0,05). Uma correlação forte, igual ou superior a 96%, foi obtida entre DF, DO e DFi. CONCLUSÃO: O método DF parece ser igualmente confiável para determinar Nv[c] e N[c] em condições normais e patológicas, apresentando algumas vantagens em relação aos métodos convencionais de dissector: redução de cortes histológicos e imagens na análise estereológica, redução do tempo de análise das imagens, a construção de DF em microscópios simples, utilizando o modo de epifluorescência, distinção de planos de dissector em ampliações inferiores.

BACKGROUND: Conventional disector methods currently require considerable financial, technical and operational costs to estimate the number of cells, including cardyomyocytes, in a 3D area. OBJECTIVE: To use fluorescence microscopy in a modified disector method to determine the number of myocytes in cardiac tissue in normal and pathological conditions. METHODS: The study employed four-month-old male Wistar rats with weight of 366.25 ± 88.21g randomized in control (CG, n=8) and infected (IG, n=8) groups. IG animals were inoculated with T. cruzi Y strain (300,000 trypomastigotes/50g wt). After eight weeks, the animals were weighted and euthanized. The left ventricles (LV) were removed for stereological analysis of numerical density of cardiomyocytes (Nv[c]) and total number of these cells in the LV (N[c]). These parameters were estimated using a fluorescent disector (FD) and compared with the conventional optical (OD) and physical (PD) disector methods. RESULTS: In both disector methods, IG animals presented significant decrease of Nv[c] and N[c] compared to CG animals (P< 0.05). There was no significant difference in these variables despite the disector method applied in CG and IG animals (P> 0.05). A strong correlation, equal or above 96%, was obtained between FD, OD and PD. CONCLUSION: The FD method seems to be equally reliable to determine Nv[c] and N[c] in normal and pathological conditions and presents some advantages compared to conventional disector methods: reduction of histological slices and images in the stereological analysis, reduction of time to analyze the images, construction of FD in simple microscopes using the epifluorescence mode, distinction of disector planes in lower magnifications.

FUNDAMENTO: Métodos convencionales de disector actualmente requieren considerables costos financieros, técnicos y operativos para estimar el número de células, incluyendo cardiomiocitos, en un área de 3D. OBJETIVO: Usar la microscopia de fluorescencia en un método de disector modificado para determinar el número de miocitos en el tejido cardíaco en condiciones normales y patológicas. MÉTODOS: El estudio empleó ratones Wistar machos de cuatro meses de edad y peso de 366,25 ± 88,21 g randomizados en grupos controles (GC, n = 8) e infectados (GI, n = 8). Los animales del GI fueron inoculados con cepa Y de T. cruzi (300.000 tripomastigotas/50 g). Después de ocho semanas, los animales fueron pesados y sacrificados. Los Ventrículos Izquierdos (VI) fueron removidos para análisis estereológico de la densidad numérica de cardiomiocitos (Nv [c]) y el número total de esas células en el VI (N [c]). Esos parámetros fueron estimados usando un disector fluorescente (FD) y comparados con los métodos convencionales de disector óptico (OD) y disector físico (PD). RESULTADOS: En ambos métodos de disector, los animales del GI presentaron caída significativa de Nv[c] y N[c] en comparación con los animales del GC (P > 0,05). Una correlación fuerte, igual o superior a 96%, fue obtenida entre FD, OD y PD. CONCLUSIÓN: El método FD parece ser igualmente confiable para determinar Nv[c] y N[c] en condiciones normales y patológicas, presentando algunas ventajas en relación a los métodos convencionales de disector: reducción de cortes histológicos e imágenes en el análisis estereológico, reducción del tiempo de análisis de las imágenes, la construcción de FD en microscopios simples, utilizando el modo de epifluorescencia, distinción de planos de disector en ampliaciones inferiores.

Quantificação de tecido conjuntivo do músculo cardíaco em equinos de tração através de técnicas histoquímicas e morfométricas / Quantification of connective tissue in cardiac muscle from horses used for traction using histochemical and morphometric techniques

Os cardiomiócitos são sustentados e inseridos em um esqueleto de tecido conjuntivo, este possui distribuição desigual de acordo com as propriedades das distintas regiões em que se encontra. O propósito deste estudo foi quantificar a proporção de tecido conjuntivo em relação à disposição de cardiomiócitos dos ventrículos direito e esquerdo e no septo interventricular do miocárdio de seis equinos subnutridos, adultos, sendo quatro machos e duas fêmeas, sem raça definida e utilizados para tração. Com auxílio de paquímetro eletrônico digital, avaliou-se a altura do ventrículo esquerdo, a largura do coração, assim como sua circunferência, as espessuras das paredes livres dos ventrículos e do septo interventricular. Os fragmentos relativos ao terço médio do septo interventricular e das paredes livres dos ventrículos foram submetidos à técnica histológica convencional. Os blocos foram cortados com espessura de 5µm e corados com Picrosirius Red, Tricromo de Gomori e Tricromo de Azan para evidenciação do tecido conjuntivo. As lâminas foram analisadas com uso do microscópio óptico digital acoplado ao programa de análise de imagens Image-Pro Plus®. A proporção média de tecido conjuntivo no ventrículo esquerdo foi de 6,1±3,7 por cento, no septo interventricular foi obtida a média de 6,8±3,6 por cento e no ventrículo direito a média foi de 6,1±3,1 por cento. Ao aplicarmos teste H de Kruskal-Wallis, verificamos que ocorreu diferença estatística entre os diferentes corantes utilizados em relação às regiões avaliadas. No teste de correlação de Pearson, não foi encontrado padrão de correlação entre a espessura das regiões analisadas e a proporção de tecido conjuntivo.

Cardiomyocytes are sustained and inserted into a connective tissue skeleton that has different distribution depending up on the properties of the region in which it stands. The purpose of this study was to quantify the proportion of connective tissue in relation to the arrangement of cardiomyocytes of left and right ventricles and interventricular septum in myocardium of six mixed breed, ill trifted adult horses, of both sexes, used for traction. With hearts still fresh and with the aid of a digital caliper, it was estimated the height of left ventricle, the heart's width, the heart's circumference and the thickness of the ventricular free walls and interventricular septum. The fragments on the middle third of the interventricular septum and free walls of the ventricles were subjected to conventional histological technique. The blocks were cut with thickness of 5µm and stained with Picrosirius Red, Gomori Trichrome and Azan Trichrome to show the connective tissue. The slides were analyzed using optical microscope coupled to a digital analysis program Image-Pro Plus®. The average proportion of connective tissue in the left ventricle was 6.1+3.7 percent, in the interventricular septum and it was observed a mean of 6.8+3.6 percent. In the right ventricle the average was 6.0+3.0 percent. Applying the H test of Kruskal-Wallis, it was found that there was statistical difference between the different dyes used for each region. In the Pearson correlation test it was not found pattern correlation between the thickness of the regions analyzed and the proportion of connective tissue.

Há proliferação de cardiomiócitos no infarto? / There is proliferation of cardiomyocytes in infarction

Pesquisa de proliferação de cardiomiócitos no infarto. Método: foram colhidas amostras de tecido miocárdico de cadáveres do Serviço de Verificação de òbito, de 19 homens e 03 mulheres. Essas amostras foram coradas com o marcador Ki 67. Realizada também a análise morfométrica dos cardiomiócitos, com objetivo de 10X, em áreas de infarto e em área normal, comparando-se o perímetro e a área dos mesmo. Resultados: mos 22 casos selecionados não foi observado nenhum núcleo de cardiomiócito marcado com Ki-67, evidenciando uma provável ausência de mitose. Em relação à análise morfométrica, o aumento do perímetro e área dos cardiomiócitos em área infartada, em relação á área normal, foi, estatisticamente, significante. Conclusão: Acreditamos que a metodologia empregada, coloração com hematoxilina e eosina e marcação com Ki-67, não é suficientemente precisa para a detecção da prolferação de cardiomiócitos, requerendo-se futuros trabalhos com maiores recursos metodológicos.

Fatores e mecanismos envolvidos na hipertrofia ventricular esquerda e o papel anti-hipertrófico do óxido nítrico: [revisão] / Factors and mechanisms involved in left ventricular hypertrophy and the anti-hypertrophic role of nitric oxide: [review]

A hipertrofia ventricular esquerda (HVE) ocorre em reposta à sobrecarga hemodinâmica relatada em várias condições fisiológicas e patológicas. Entretanto, ainda não está completamente elucidado se o estímulo primário para a hipertrofia é o estiramento mecânico do coração, fatores neuro-humorais, ou mesmo a interação de ambos. Esses fatores são traduzidos no interior da célula como alterações bioquímicas que levam à ativação de segundos (citosólicos) e terceiros (nucleares) mensageiros que irão agir no núcleo da célula, regulando a transcrição, e finalmente determinarão a expressão gênica que induza HVE. A HVE é caracterizada por alterações estruturais decorrentes do aumento das dimensões dos cardiomiócitos, da proliferação do tecido conjuntivo intersticial e da rarefação da microcirculação coronariana. Nos últimos anos, o óxido nítrico (•NO) surgiu como um importante regulador do remodelamento cardíaco, especificamente reconhecido como um mediador anti-hipertrófico. Vários estudos têm demonstrado os alvos celulares, as vias de sinalização anti-hipertrófica e o papel funcional do •NO. Portanto, a HVE parece desenvolver-se em decorrência da perda do balanço entre as vias de sinalização pró e anti-hipertróficas. Esses novos conhecimentos sobre as vias de sinalização pró e anti-hipertróficas permitirão desenvolver novas estratégicas no tratamento das HVE patológicas.

The left ventricular hypertrophy (LVH) occurs in response to the hemodynamic overload in some physiological and pathological conditions. However, it has not been completely elucidated whether the primary stimulation for the hypertrophy is the mechanical stretching of the heart, neurohumoral factors, or even the interaction of both. These factors are translated inside the cell as biochemical alterations that lead to the activation of second (cytosolic) and third (nuclear) messengers that will act in the cell nucleus, regulating transcription, and will finally determine the genic expression that induces LVH. The LVH is characterized by structural alterations due to the increase in the cardiomyocyte dimensions, the proliferation of the interstitial connective tissue and the rarefaction of the coronary microcirculation. Recently, nitric oxide (•NO) has appeared as an important regulator of cardiac remodeling, specifically recognized as an anti-hypertrophic mediator. Some studies have demonstrated the cellular targets, the anti-hypertrophic signaling pathways and the functional role of •NO. Thus, the LVH seems to develop as a result of the loss of the balance between the pro and the anti-hypertrophic signaling pathways. This new knowledge about the pro and anti-hypertrophic signaling pathways will allow the development of new strategies in the treatment of pathological LVH.

Compact cell image projector: application to study the relationship between stimulus interval and contraction amplitude in isolated rat cardiomyocytes / Projetor compacto de imagem celular: aplicação ao estudo da relação entre intervalo entre estímulos e amplitude de contração em cardiomiócitos isolados de rato

Cardiac inotropy depends, among other factors, on the interval between contractions. In this study, we developed instrumentation for cell shortening recording, which was used to investigate the influence of stimulatory rhythm on contraction amplitude of isolated rat ventricular myocytes. Peak cell shortening amplitude was recorded during electric stimulation at the average rate of 0.5 Hz with different stimulatory patterns: regular and pseudo-random rhythms, as well as double pulse stimulation. Cells were perfused at 23 ºC with modified Tyrode’s solution with or without 10 nM isoproterenol (ISO). The main advantages of the developed microscopy system were its relatively low cost(~US$ 1,000.00), small size (150 × 170 × 300 mm), and absence of detectable optic distortions. We observed that average contraction amplitude was similar for all stimulatory patterns, in the absence and presence of ISO (p > 0.05), although the amplitude of individual contractions was highly dependent on the previous interval, and was significantly increased by ISO (p < 0.05). With the double pulse patterns, the amplitude ratio of contractions following the shorter and the longer intervals was ~0.55. ISO positive inotropic effect was more prominent for contractions after short intervals, which increased the ratio to ~0.80. This might be explained by acceleration of the recovery of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release channels from the adapted state, possibly by proteinkinase A-dependent phosphorylation, which would resultin enhanced systolic Ca2+ release.

O inotropismo cardíaco depende de inúmeros fatores, entre eles o intervalo entre contrações. Neste trabalho, desenvolvemos instrumentação para registro de encurtamento celular e investigamos a influência do ritmo estimulatório sobre a atividade contrátil de miócitos ventriculares isolados de rato. A amplitude do encurtamento celular foi registrada durante estimulação elétrica à freqüência média de 0,5 Hz, com ritmo regular, ritmo pseudoaleatório e pulsos duplos. Os miócitos foram perfundidos a 23 ºC com solução de Tyrode modificada contendo ou não 10 nMde isoproterenol (ISO). O sistema de microscopia desenvolvido é de custo relativo baixo (~US$ 1.000,00), dimensões reduzidas(150 × 170 × 300 mm) e apresenta boa qualidade óptica (sem distorções ou paralaxe detectáveis). Observamos que a amplitude média das contrações foi semelhante em todos os ritmos estimulatórios na ausência e presença de ISO (p > 0,05), embora a amplitude de contrações individuais fosse dependente do intervalo precedente, e ISO tenha causado aumento da amplitude média das contrações (p < 0,05). Nos padrões com pulso duplo, a razão de amplitude das contrações que seguem o menor e o maior intervalo foi ~0,55. O efeito inotrópico positivo de ISO foi mais pronunciado para contrações após intervalos curtos, o que levou a razão para ~0,80. Isto poderia ser explicado por aceleração da recuperação dos canais de liberação de Ca2+ do retículo sarcoplasmático do estado adaptado, causada possivelmente por fosforilação pela proteína quinase A, o que aumentaria a quantidade de Ca2+ liberada durante a sístole.

El papel del factor de transcripción NF-κB en la célula cardíaca / Role of the transcription factor NF-κB in the cardiac cell

Para la biología de hoy las vías de señalización intracelular que controlan los procesos entre la vida y la muerte celular son de gran interés. Al respecto, el NF-κB destaca como un factor de transcripción decisivo de respuesta rápida que participa en la activación de las vías de señalización de la muerte celular programada. Lo relevante es que sus efectos tienen consecuencias en el desarrollo normal y/o la homeostasis en muchas células o tejidos, que incluyen entre otros al sistema inmune, los folículos capilares, apéndices epidermales, el riñon y el sistema nervioso. En esta revisión analizamos el papel central que juega el factor de transcripción NF-κB en el funcionamiento normal de la célula cardíaca y sus implicaciones en algunas de las patologías cardíacas más frecuentes como: el daño por isquemia-reperfusión, la isquemia precondicionada, la hipertrofia, la aterosclerosis, y el paro cardíaco. El NF-κB comúnmente funciona como un agente citoprotector, aunque hay algunos casos en los cuales resulta ser pro-apoptótico dependiendo del estímulo y del contexto celular. Se han logrado avances significativos a nivel molecular, que han permitido entender su modo de acción y el papel interactivo que juega con otros factores claves. Estos estudios han identificado muchos genes anti-apoptóticos y pro-apoptóticos regulados por la actividad del NF-κB abriendo novedosas aproximaciones que se pueden hacer sobre sus efectos en el desarrollo de patologías cardíacas.

The signaling pathways that control the life-death switch of a cell are a prime interest in Modern Biology. To this respect, NF-κB has emerged as a decisive transcription factor in the cell's response to apoptotic challenge and its effects on apoptosis have far-reaching consequences for normal development and/or homeostasis in many cells and tissues, including the immune system, hair follicles, and epidermal appendages, the liver, and nervous system. In this review we analyze the pivotal role of the transcription factor NF-κB in the normal functioning of the cardiac cell and its implication on some of the most frequent cardiac pathologies, such as ischemia-reperfusion injury, ischemic precondition, hypertrophy, atherosclerosis and cardiac arrest. While NF-κB is commonly found to be cytoprotective, there are a number of instances where it is proapoptotic depending on the inducing stimulus and the cell context. Significant progress has been made in understanding its mode of action and its interplay with other key factors. These studies identified many anti- and pro-apoptotic NF-κB regulated genes that mediate its activity, these important new insights fuel hope that novel approaches will be developed to control the effects of NF-κB in cardiac pathologies.

Regeneración miocárdica en Ambystoma mexicanum después de lesión quirúrgica / Myocardial regeneration in Ambystoma mexicanum after surgical injury

Se realizó resección ventricular en el corazón de Ambystoma mexicanum, se evaluó si la restitución del tejido resulta de hipertrofia o de hiperplasia. Por medio de una tinción tricrómica se encontró que 5 días después del daño en el espacio de la resección se encontró un coágulo rodeado de fibras de colágena (83 ± 6%), músculo (10 ± 3%) y zonas sin tejido (7 ± 2%). Una proporción de 50 ± 4 y 90 ± 2% correspondió a tejido muscular 10 y 30 días después de la lesión. La tinción con bis-Benzimida indicó que en la zona lesionada hay proliferación celular. En tanto que la inmunohistoquímica doble para actina sarcomérica a y antígeno nuclear de proliferación celular mostró que el tejido que restituyó el espacio se produjo por proliferación de cardiomiocitos con un valor máximo de 68%, 5 días después de la lesión. Nuestros resultados indican que el miocardio de A. mexicanum recupera su estructura mediante la hiperplasia de cardiomiocitos y sugieren que su capacidad regenerativa es mayor que la informada para mamíferos adultos (1%), y para otros vertebrados no mamíferos (32%). Esto hace de A. mexicanum un modelo idóneo para estudiar los mecanismos reguladores de la regeneración miocárdica per se, en vertebrados adultos in vivo.

Ventricular resection of the heart of Ambystoma mexicanum was performed and the type of tissue that restored the lesion and if it is by hypertrophy or hyperplasia of myocardium, were evaluated. Masson's trichrome stain indicated that 5 days after resection, the gap was occupied with a blood clot surrounded by collagen fibres (83 ± 6%) and muscle (10 ± 3%) and the rest of area (7 ± 2%) free of tissue. A proportion of 50 ± 4 and 90 ± 2% was muscular tissue, 10 and 30 days after injury. The evaluation with bis-Benzimide indicated cell proliferation in the injured area. The double immunohistochemistry for a-sarcomeric actin and proliferating cell nuclear antigen indicated that the tissue that occupied the injury-produced gap was originated by cardiomyocyte proliferation, which presented a maximum of 68%, 5 day after injury. Our results indicate that the myocardium of A. mexicanum recovers its structure through cardiomyocyte hyperplasia and suggest that the myocardial regenerative capacity is higher than the reported for adult mammals (1%) and other non-mammalian vertebrates (32%). This characteristic makes A. mexicanum a suitable model to study the mechanisms that regulate per se, the myocardial regeneration in adult vertebrates in vivo.